Kjeldahl
Dumas
Destilación directa
2- Colorimétrico:
Biuret
Enlace de colorante
3- Espectrofotométrico
4-Fijación de colorantes
5-Instrumentales
RNM resonancia nuclear magnética
IR Infrarrojo
Kjeldahl responde al siguiente esquema, oxidación de la muestra y conversión del nitrógeno en sulfato de amonio, descomposición del sulfato de amonio en amoniaco, debido al agregado de solución de hidróxido de sodio, destilación del amoniaco y evaluación del mismo.
Kjeldahl : las proteínas contienen los siguientes elementos en sus estructuras C, O, H, y N (carbono, oxigeno, hidrogeno y nitrógeno), el objetivo de este método es separa el nitrógeno de los otros componentes.
1º Etapa: Digestión
materia orgánica ................. materia inorgánica
ambiente oxidante, catalizador, diferentes reactivos, altas temperaturas (400ºC) Se produce una reacción Redox
CO ............ CO2↑
HO ............ H2O↑
N ............ NH3 (NH4+ porque el medio es ácido)
Midiendo la cantidad de NH4 + → me da la cantidad de Nitrógeno
¿QUÉ SE AGREGA EN LA DIGESTION?
1)SO4H2 Conc. 98%: tiene poder oxidante y carboniza la materia orgánica (carboniza inicio de mineralización) en frío.
2) Catalizadores: Hay 4 posibles
1- SO4Cu Sulfato cúprico, no es el mejor catalizador, pero si él más económico tiene un color marrón
2-Se/ SeO Selenio u Oxido de Selenio
3- TiO2 oxido titanio
A los catalizadores 2 y 3 se les agrega H2O2, son buenos, pero tiene la desventaja de ser caros
4- HgO oxido mercurio, utilizar este catalizador nos obliga a hacer un paso más en el final de la operación, se acompleja con el NH4+ y no lo podemos medir. Tenemos que romper el complejo para medir el Nitrógeno. Se hace una precipitación del Hg con S (-2) o S2O3(-2) (sulfuro o tiosulfato) y luego filtración y lavado.
3) Sales para Elevación de Punto de ebullición
Se emplea SO4K2 sulfato de potasio y SO4Na2 sulfato de sodio, el efecto es que elevan de 180ºC a 400ºC
El tiempo de la digestión depende del equipo en el Kjeldahl hay 3 equipos:
1- macro (mas cantidad de muestra), se necesita mas técnicos para la determinación, cantidad de muestra desde ½ gr a 20 gr
2- semimicro 1 gr y décimas
3- micro muy experimentados 10 mg
Dependiendo de la elección del equipo, la digestión lleva desde 1 hora hasta varias horas de digestión, esto dependerá de la cantidad de SO4H2 concentrado, tenemos una solución verdosa (catalizador. SO4Cu)
La digestión concluye cuando se obtiene una solución trasparente, sin emisión de humos, con los otros catalizadores no hay variación de color.
2º Etapa: DESTILACIÓN
La destilación comprende varios pasos:
1- dilución: SO4K2 + SO4NH4 → como es muy reactivo se agrega H2O, obteniéndose una solución menos peligrosa, se debe agregar el agua por el cuello y revolver.
2- En el caso de haber utilizado HgO como catalizador lo precipito con S -- + S2O3, luego lo filtro y lavo
3- Neutralización, se realiza esta operación con el objeto de pasar NH4 a NH3 (gas) y que luego se titula con NaOH30- 40 % P/V.
4- Inmediatamente se debe poner el balón para destilar, antes debo agregar NaOH porque sino pierdo NH3(gas)
La destilación tiene un tiempo de ½ hora aproximadamente, el refrigerante a utilizar se debe colocar en posición vertical, puede ser de bolas o el común. Puede llegar a suceder que hala mas NH3 que H2SO4, para saber si hay mas NH3 o H2SO4 se agrega un catalizador rojo de meilo ácido = rojo neutro = amarillo, tiene que mantenerse rojo PH Acido quiere decir que hay H2SO4.
3º Etapa: TIULACION
La cantidad de NH3 se titula con solución de NaOH valorada 0.1 N, titulamos el H2SO4 que solo por diferencia sabemos la cantidad de NH3 que reacciono con H2SO4, sacamos el volumen y por resta nos da el H2SO4 que reacciono con el NH3.
Existe una alternativa, una variante para la recolección y titulación, se puede hacer la recolección sobre una solución de BO3H3 / Acido Bórico) da un complejo (acido- Base) con el NH3
NH3 → BO3H3) se acompleja, no tiene que ser valorada la solución de BO3H3 ácido bórico, la titulación se hace con solución H2SO4 valorada generalmente 0,1 N formando SO4NH4.
V SO4H2 x N SO4H2 x f SO4H2 = meq SO4H2 agregados en el erlermeyer (1)
V NaOH x N NaOH x f NaOH = meq SO4H2 sobrantes (2)
La resta entre las ecuaciones numéricas (1) y (2) da como resultado lo siguiente:
meq. SO4H2 reaccionados con NH3 ≡ equiv. NH3 ≡ equiv. N itrogeno
Para calcular la concentración de nitrógeno en la muestra:
( V x N x f SO4H2 - V x N x f NaOH ) x 14 mgrs/ meq N / Peso Muestra
Na = 0,1 N
Nb = 0,1 N como ambos tienen la misma normalidad se saca factor común
Como debo sacara él % Nitrógeno
% N =(Va x Na x fa - Vb x Nb x f b ) meq N x 14 mgrs/ meq N x 100 / Peso muestra
% N= ( Va x fa x Na - Vb x Nb x fb ) x 0,14 / peso muestra
% N= ( Va x fa - Vb x fb ) x 0,14 / Peso muestra
Las proteínas tienen mas o menos la misma cantidad de nitrógeno en promedio 16 gramos de Nitrógeno/ 100 gramos de proteínas.
100 grs proteína / 16 grs Nitrógeno = 6, 25 grs prot/grs N (factor de conversión del Nitrógeno a Proteina )
% Prot=(Va x0.1N x fa - Vb x0.1 N x f b )meq N x14 mgrs/meq N x6.25 mgrprot/mgr N x 100grs. / Peso muestra(grs) 10³ mgr/grs
% Proteína = ( Va x fa - Vb x f b ) 0.14 x 6.25 / Peso muestra(grs)
Si trabajamos con BO3H3/SO4H2
% Proteína = Va x fa 0.14 x 6.25 / Peso muestra(grs)
Factor de conversión: 16 gramos de nitrógeno / 100 gramos proteína
Cada alimento tiene un factor de conversión , por unificación e criterio se toma 6,25 , hay algunos alimentos donde se utiliza otros factores de conversión:
Trigo 5.70 % alta de glutamina
Leche 6.38 % un poco menos de N ( % ↑ caseína)
Gelatina 5,55 lisina mayor cantidad de Nitrógeno
Las ventajas del método KJELDAHL:
Método muy preciso y muy reproducible, da valores exactos.
Método universal, se puede aplicar a cualquier muestra (sólida, liquida, gaseosa)
Método absoluto, mide realmente el N de la muestra, por medio de la formula.
Mide Nitrógeno Total, es una desventaja, me da cualquier nitrógeno
En una muestra (alimento) esta constituido por proteínas, lípidos, aminoácidos, ácidos nucleicos y base purinicas, bases nitrogenadas(aminas) alcaloides, estos últimos 4 nombrados son nitrógeno no proteico, los 3 primeros son nitrógeno proteico.
La parte proteica conforma el 90% del nitrógeno total, la parte no proteica es el 10 % restante.
La determinación directa de Nitrógeno total, se llama PROTEINA BRUTA O CRUDA
Pero si queremos conocer el Nitrógeno proteico debemos hacer otra operatoria:
Se toma una 2º muestra más solución de tricloro acético ( Cl3C-COOH) , este precipita las proteínas y polipéptidos ( precipita generalmente proteínas los aminoácidos no los hace precipitar), luego se filtra correspondientemente. Se hace una segunda determinación de Kjeldahl que me da el Nitrógeno no proteico( en solución ) por diferencia:
Nitrógeno total – Nitrógeno no proteico = Nitrógeno proteico x 6,25 = Proteína verdadera
Proteína verdadera ≡ a la cantidad que tendría la muestra.
DESTILACIÓN DIRECTA: existe una alternativa del método Kjeldahl
La muestra se coloca en un balón tipo Kjeldahl y se le agrega SO4K2 y SO4Na2 + NaOH ( concentrado al 40 % P/P) y se destila directamente , esta alternativa nos permite realizar una determinación de proteínas en dos etapas destilación y titulación , con el ataque alcalino tengo un cierto grado de hidrólisis hay desprendimiento de nitrógeno de la cadena lateral, los aminoácidos son os que tiene nitrógeno en la cadena lateral ( lisina, argenina, aristidina, glutamina).
Hay desprendimiento de NH3 , este método en 15 minutos da un resultado , y se completa con la ultima etapa la titulación del SO4H2 sobrante . De la titulación se calcula él % Nitrógeno, igual que la formula de Kjeldahl
% Nitrógeno = ( Va x fa - Vb x f b ) 0.14 / Peso muestra(grs)
Ventajas de la Implementaciòn de esta alternativa , menor tiempo en obtener un resultado , y menos trabajo de armado de equipo solo un equipo se arma el de destilación.
Las desventajas de este método, es que no es un método absoluto, es relativo, porque no hay formación de NH3 de las uniones peptidícas que no se descomponen y no da NH3 para medirlo.
No da nitrógeno total sino relativo, él % de Nitrógeno no lo podemos trasformar en proteínas porque no sabemos el factor.
Cada tipo de proteína tiene una composición porcentual distinta de nitrógeno, por consiguiente las distintas proteínas me dan cantidades de NH3 diferentes y a su vez contiene diferentes aminoácidos.
Se lo considera un método relativo porque es necesario tener una curva de calibrado con un método absoluto (Kjeldahl)
Se debe tener en cuenta el tipo de muestra con que se trabaja , por ejemplo, si deseamos medir el % de proteína en porotos, tenemos que tomar distintas muestras y a estas le aplicamos los 2 métodos, esto seria prácticamente ; tomo una muestra y la denomino muestra 1 y la analizo por el método alternativo de destilación directa y el método Kjeldahl , a su vez tomo otra muestra la numero 2 y así sucesivas muestra , como mínimo deberé tener 5 resultados , esto implica que deberé realizar 5 tomas de muestras y analizar por los dos métodos el absoluto y el relativo.
Luego gráfico aritméticamente estos resultados en un sistema de ejes cartesianos % Nitrógeno relativo en función de % Nitrógeno absoluto, y comparo
Como se dijo anteriormente como mínimo se deberá tener 5 o mas puntos para la construcción de la gráfica , se producen grandes errores si usamos 2 o 3 puntos .
Si tomamos como alternativa el análisis del maíz obtendremos otra gráfica , ya que el maíz posee diferentes aminoácidos en las proteínas que lo constituyen .
METODO DE DUMAS.
Se lo incluye dentro de los métodos volumétricos , la muestra se la coloca en un bloque que se calcina a 800- 1000 ºC , lo que se logra con esta calcinación es una mineralización de la muestra , se produce el calentamiento en presencia de un catalizador ( V2O5/CuO)
CO CO2 el H y O se combinan forman H2O se evapora
S SO2, SO3
N N2 ( nitrógeno Molecular)
Se colocan una serie de trampas , donde se retiene Co2 , H2O y SO2/SO3
El CO2 se puede atrapar con bicarbonato , el H2O con soluciones anidras , con H2O se atrapa el SO2/SO3 dando ácidos , como el N2 esta en esta molecular ( gas) se mide el volumen recolectado , calculando el numero de moles de Nitrógeno , se calcula la cantidad de nitrógeno presente en la muestra . En la actualidad los avances tecnológicos nos permiten determinar nitrógeno en menor tiempo , enviando el nitrógeno a un cromatografo de gases .
El método de DUMAS mide Nitrógeno total, exactamente igual que Kjeldahl, luego el nitrógeno total , se debe desdoblar en Nitrógeno proteico y no proteico , obteniendo el porcentaje de proteína bruta o pura..
Es un método absoluto , también se lo reconoce como un método universal ,mide cualquier muestra sin importar su estado, es un método preciso , exacto reproducible pero tiene 2 inconvenientes principales:
1- La muestra es una muestra pequeña ( entre 10 y 50 mgrs) se presentándose problemas en la homogeneidad, obteniéndose errores por muestra.
2- Es un método moderno y se obtiene resultados rápidos , pero es un equipo muy caro .
METODO COLORIMETRICO
BIURET es un método basado en una reacción química
Los iones Cu(+2) tienen interacción con la cadena proteica, reacciona como mínimo con 2 uniones peptídica, produciéndose una fijación en la unión peptídica. Formándose una densidad electrónica, donde en esa densidad electrónica se puede acomplejar los iones Cu (+2). Este complejo tiene un color púrpura, este color es proporcional a la cantidad de proteínas presente en la muestra , el color es una función dependiente de la concentración de la proteína .
C = f (conc. Prot.)
Para la determinación de proteína por este método se prepara una solución Biuret (especial) formada por SO4Cu, NaOH y tartrato de Potasio (estandarizando los iones Cu(+2)
La solución preparada tiene un tiempo de duración de 3 meses, este reactivo se le agrega a un determinado volumen de proteína en solución, y se lo mide en un espectrofotometro.
Pasos para le determinación de proteína con el método de Biuret:
1- reacción Cu(2+) / proteína
2- Medida de la absorción ( 550µ)
3- Calculo de la concentración por curva de calibrado.
La curva se hace tomando distintas muestras haciendo Biuret y Kjeldahl , obteniéndose una recta o curva de calibrado
Características de este método mide Nitrógeno proteico el Cu (+2) no se une a otro Nitrógeno que no sea proteico dándonos como resultado proteína verdadera.
La desventaja de este método es que, es un método relativo , y se necesitan curva de calibrado distintas para distintas muestra, esto se debe a que el Cu (+2) se une de distintas formas con las distintas proteínas de los alimentos .El grado de interacción Cu (+2) / proteína es distinto.
No es método universal: la proteína la tengo que tener en solución sino el Cu (+2) , no se une , es solo aplicable este método a proteína en solución. Ejemplo, no se puede determinar proteína en la carne, poroto, etc. Previamente antes de la determinación se debe solubilizar la proteína, pero así mismo no determino el valor real de toda la proteína.
ENLACE DE COLORANTES
Se basa en una reacción de la proteína con diferentes colorantes, son colorantes sulfurados
Todos los colorantes sulfonados tienen la unión doble enlace N=N además de tener uno o más grupo sulfonicos SO3 (-) H (+), que surge de la reacción H2SO4 con un azúcar reductor
SSO3H SO3(-) + H(+)
SO3(-) = grupo sulfonico
En la proteína , nos encontramos con cargas (+) entre PH neutro y atraen a los grupos SO3(-), las cargas (+) pueden encontrarse en la cadena lateral o extremos de la cadena, por ejemplo la lisina.
SO3(-) NH3 (+)
Es muy común encontrar soluciones de proteínas con cargas (+). Cuando las proteínas se unen con esos colorantes sulfurados se produce una precipitación , separándose la proteína del resto de la solución, no se mide volumétricamente , sino que se mide el sobrante de colorante , colocando una cantidad conocida
Pasos para la determinación de proteína por enlace de colorantes
1- reacción colorante/ proteína ( exceso de colorante)
2- filtración
3- medida y observación de la absorción en el filtro
4- calculo de concentración por curva de calibrado
La recta de calibrado es decreciente porque si hay mas proteína sobrante se tendrá menor cantidad de colorante Este método es muy rapido y útil , nos permite utilizar muestras sólidas ( se muelen ) las partículas reaccionan con el colorante, pero este es un método relativo , para este método los colorantes mas comunes que se utilizan son “naranja” (orange) es aplicable para cereales y el colorante azul , Negro Amido , que se utiliza en leche , es un método muy rapido 10 minutos aproximadamente , con bajo consumo de reactivo
METODOS INSTRUMENTALES
Absorvancia en UV : es característico que los anillo aromáticos de los aminoácidos, tiene una absorvancia de 280 mμ esta dada por las proteínas que constituyen los siguientes aminoácidos tironina y triptofano , las diferencias de proteína presentan una cantidad diferente de Cu que se absorbe , por lo consiguiente estas dos proteínas me darán diferentes niveles de absorvancia , para la Implementaciòn de este método necesito un espectrofotometro de tipo UV- visible y debo trabajar con una curva de calibrado.
Las curvas que voy a obtener serán diferentes porque los aminoácidos poseen diferentes cantidades de estas tironina y triptofano
Infrarrojo: Hay equipos de reflectancia y de trasmitancia de IR
En los equipos de reflectancia, una proporción de la muestra se absorbe y otra la refracta.
En los equipos de trasmitancia se mide la cantidad de luz que paso a través de una solución a determinar que contiene la nuestra .
